Pembrolizumab（Keytruda，MK-3475，Merck）是針對PD-1受體的抑制劑，于2014年9月被FDA批準用于治療轉(zhuǎn)移性黑色素瘤以來，腫瘤醫(yī)生獲得了一個治療癌癥的新工具。美國前總統(tǒng)卡特在經(jīng)過PD-1抑制劑治療后，治愈了晚期黑色素瘤。這讓PD-1抑制劑一躍成為很多人眼中的“抗癌神藥”。目前很多研究已經(jīng)證實MSI-H/dMMR患者能夠從免疫檢查點抑制劑的治療中獲益。因此需要在治療前對患者進行微衛(wèi)星不穩(wěn)定性檢測，以評估患者是否能從PD-1治療中獲益。

（一）MMR-IHC方法（Immunohistochemistry, IHC）

常用免疫組織化學(xué)的方法，檢測腫瘤組織中錯配修復(fù)基因MLH1、MSH2、MSH6及PMS2的表達蛋白。任何一項蛋白的缺失，即為dMMR，間接說明微衛(wèi)星不穩(wěn)定（MSI），否則即為pMMR，間接說明微衛(wèi)星穩(wěn)定（MSS）。此方法檢測MSI相對較簡單，成本較低，大部分病理科均可進行檢查。

定位準確，染色清晰，背景干凈

從全世界發(fā)病水平看，中國女性乳腺癌的發(fā)病和死亡水平較低。但由于中國人口基數(shù)大，中國仍是乳腺癌國，發(fā)病和死亡絕對數(shù)量均位列全球首位。

中杉金橋錯配四項

中杉金橋 PK 常規(guī)

（二）分子水平的檢測

1.MSI-PCR技術(shù)（polymerase chain reaction, PCR)

目前主要采用多重熒光PCR結(jié)合毛細管電泳的方法，來比較腫瘤組織與正常組織的位點突變情況。其用于比較的位點為美國國家癌癥研究所（NCI）推薦的5個微衛(wèi)星位點：BAT25、BAT26、D5S346、D2S123及D17S250。其中≥2個位點發(fā)生改變判定為高度微衛(wèi)星不穩(wěn)定（MSI-H），僅1個位點發(fā)生改變判定為低度微衛(wèi)星不穩(wěn)定（MSI-L），無位點改變判定為微衛(wèi)星穩(wěn)定（MSS）。

但是關(guān)于最適合MSI檢測的位點仍存在爭議。大量的實驗證實，MMR免疫組化檢測結(jié)果與MSI的PCR檢測結(jié)果有高度關(guān)聯(lián)性，靈敏度92%，特異性可達100%，但花費較高，且在結(jié)果判斷中會碰到以下問題：如熒光的過強或過少、非特異性峰、不顯著的峰大小改變，雜合性缺失等。

2.MSI-NGS方法（Next Generation Sequencing, NGS）

NGS做為新一代測序方法，又稱為第二代測序技術(shù)，是一種高通量測序技術(shù)，能一次性對幾十萬到幾百萬條基因分子進行序列測定。目前NGS方法已經(jīng)成為檢測MSI的新工具，其最大優(yōu)勢是可以實現(xiàn)多位點高通量檢測。

美國病理學(xué)家學(xué)會與分子病理學(xué)和抗擊結(jié)直腸癌協(xié)會組織專家共召開了8次會議，審查了103篇相關(guān)文獻，對文章提供的數(shù)據(jù)進行提取和定性分析，制定了該指南——《Mismatch Repair and Microsatellite Instability Testing for Immune Checkpoint Inhibitor Therapy》

該指南在評估現(xiàn)有的檢測方法時，考慮了錯配修復(fù)蛋白MLH1、MSH2、MSH6和PMS2的IHC，以及基于PCR的MSI檢測和通過NGS檢測DNA錯配修復(fù)缺陷的MSI，并總結(jié)出6項建議和3項聲明。

第一：針對結(jié)直腸癌（CRC）患者，指南強烈建議病理學(xué)家使用MMR-IHC或MSI-PCR的方法確定微衛(wèi)星不穩(wěn)定性。雖然NGS檢測可用于確定CRC患者MSI以評估檢查點抑制劑使用資格，但免疫組化和PCR是首選方法。專家小組成員認為：“NGS檢測必須通過MMR-IHC或MSI-PCR一致性驗證，并且必須顯示兩者具有等效性。”

第二：對于胃食管癌或小腸癌患者，應(yīng)使用MMR-IHC或MSI-PCR，而不是NGS。

第三：對于子宮內(nèi)膜癌患者，強烈推薦使用MMR-IHC而不是MSI-PCR或基于NGS的MSI檢測。

第四：除CRC、胃食管腺癌、小腸癌和子宮內(nèi)膜癌以外的其他癌癥類型，腫瘤學(xué)家和病理學(xué)家應(yīng)注意“必須針對特定的癌癥類型進行充分驗證，仔細評估MMR-IHC、MSI-NGS、MSI-PCR檢測DNA錯配修復(fù)缺陷的性能特點。”

Broaddus坦言：“第四項建議更多地是對巨大知識差距的關(guān)注，而不是具體的建議。廣泛的NGS檢測可能對試圖通過一次評估獲取盡可能多腫瘤分子信息的腫瘤學(xué)家有吸引力，但這種便利不應(yīng)超過這樣一個事實，即對于許多癌癥類型，尚沒有足夠的證據(jù)表明NGS可準確地確定dMMR或MSI狀態(tài)。臨床醫(yī)務(wù)工作者需要意識到，如果對患者進行NGS，可能會錯過其他癌癥類型的高水平MSI，尤其是胃腸道癌癥之外的其他癌癥。

第五：不應(yīng)將腫瘤突變負荷（TMB）視為檢測dMMR狀態(tài)的替代指標。如果腫瘤被確定為TMB-H，病理學(xué)家可以通過MMR-IHC或MSI-PCR的檢測，來確定TMB-H是否繼發(fā)于dMMR。雖然對于CRC，TMB-H與dMMR有很多重疊，但對于其他癌癥類型，兩者重疊很小。

對于第五條建議，Broaddus及其同事強調(diào)：“ TMB-H雖然在某些情況下可能是dMMR或MSI-H狀態(tài)的標志，但并不能視為與其他兩個生物標志物相同?！?/P>

第六：如果對患者進行免疫檢查點抑制劑資格分析后發(fā)現(xiàn)與Lynch綜合征一致的dMMR，強烈建議病理學(xué)家將此發(fā)現(xiàn)傳達給患者的主治醫(yī)生，因為這種遺傳性綜合征意味著會增加其他癌癥風(fēng)險。”

三個良好實踐聲明集中在腫瘤學(xué)家和病理學(xué)家如何處理不一致的檢測結(jié)果。這一點對于IHC尤其重要，因為專家在許多指南中首先推薦IHC檢測方法。不過在特定情況下，該方法可以根據(jù)病理學(xué)家的個人解釋產(chǎn)生不同的結(jié)果。新指南中包含的良好實踐聲明在處理差異方面提供了一些指導(dǎo)。

Broaddus表示：“IHC的好處在于更普遍，很多基礎(chǔ)的臨床實驗室能夠進行這一操作，但缺點是具有一定的主觀性，而且需要具備一定的專業(yè)知識。從長遠來看，病理學(xué)家的培訓(xùn)計劃應(yīng)該包括解釋IHC的檢測結(jié)果。”

第一：如果檢測結(jié)果不一致，病理學(xué)家應(yīng)采用IHC、NGS、PCR檢測MSI其中的任何陽性結(jié)果，從而允許患者接受免疫治療。但對不一致的結(jié)果應(yīng)進行嚴格審查，確定這種不一致的現(xiàn)象不是由錯誤的解釋所導(dǎo)致的。

第二：如果任何方法的結(jié)果不確定，病理學(xué)家應(yīng)執(zhí)行替代技術(shù)或在不同的腫瘤塊上重復(fù)相同的技術(shù)。對不確定檢測結(jié)果的情況，實驗室應(yīng)該建立一個全面的同行評審程序。

第三：在MMR-IHC亞克隆缺失的情況下，病理學(xué)家應(yīng)通過PCR進行MSI驗證，特別是在IHC丟失MMR蛋白的腫瘤解剖區(qū)域。

該指南對MMR-IHC的強調(diào)，特別是對結(jié)直腸癌、胃食管、胃食管連接處、小腸以外的腫瘤類型。Large-panel NGS無疑為癌癥患者提供了更多的基因組信息，有時甚至可以識別Lynch綜合征患者。有證據(jù)表明，MSI-NGS對于正在考慮接受免疫檢查點抑制劑治療的CRC、胃食管、胃食管結(jié)合部、小腸癌患者是一種很好的檢測方法。

然而，這些相同的MSI-NGS方法對于其他類型的癌癥通常不是好的檢測方法的，因為沒有足夠已發(fā)表的證據(jù)支持。為了準確檢測這些其他癌癥類型中的MSI-H，可能需要開發(fā)出每種腫瘤類型特有的替代NGS算法。

驗證MSI-NGS方法的相關(guān)幾項研究中存在另一個缺點：MMR-IHC或MSI-PCR接近100%的一致性，這通常不能解釋由于低標本腫瘤細胞純度（在一項研究中接近25%的病例）或由于不確定的結(jié)果（在一項研究中為15%）而排除的病例。顯然，對于許多活組織檢查或細針穿刺來說，NGS的低腫瘤細胞分數(shù)的限制是一個重要的問題，惡性腫瘤的診斷可能僅基于少數(shù)腫瘤細胞的存在。有發(fā)表的關(guān)于MSI-NGS效用的大型研究，其包括數(shù)千名患有許多不同癌癥類型的患者，該研究數(shù)據(jù)表明：通常MSI僅在結(jié)直腸癌或子宮內(nèi)膜癌患者中通過MMR-IHC或MSI-PCR驗證，因為dMMR在這些癌癥類型中更為常見，而許多其他類型的癌癥缺乏關(guān)鍵的交叉分析驗證。